項目名稱 2008 年進度報告關於一個新穎的癌症篩選方法, 使用錯配連結蛋白去檢測在體液裡腫瘤導出的突變DNA
主要研究人員 包立怡助理教授香港, 沙田, 香港中文大學內科及藥物治療學系


基因突變是癌症的成因,並只能在癌細胞裡被找到。 為及早檢測癌症,我們打算研發一種方法去篩選人的液體或廢物,譬如血液或糞便,從癌細胞散發出的突變的脫氧核糖核酸 (DNA),允許症狀發生前的癌症篩選並因此使外科或其他治療的痊癒率可以比現在更高。

方法需要從人的分泌液或糞便提取目標基因的DNA, 加熱和冷卻去重組DNA 雙鏈,並且豐富異源雙鏈 — 由於一個突變而產生的DNA序列錯配 — 允許以排序作突變的檢測。被固定的錯配連結蛋白能通過連結DNA異源雙鏈同時容許其他DNA被沖走,執行這豐富。為了測試方法,短小的,合成DNA單鏈,有或沒有突變,被合併組成同源或異源雙鏈,接著以低比率的異源比同源雙鏈被混和及豐富為異源雙鏈。一個單鹼基缺失被豐富了29倍,並且一個錯配被豐富了2倍。

接著,我們測試了方法在聚合酶連鎖反應(PCR) 產品上,是更長的,DNA雙鏈,增殖自已被純化的,人的DNA。但是,豐富未能實現。失敗的一個可能的起因是人為構造的錯配出現在PCR引子,短小的合成DNA鏈,被用於在PCR中引發增殖作用。在大體上的少數或更大多數個別的引子分子,最少一合成DNA錯誤可以發生在各個分子之內的某處。這些錯誤表現如突變,形成導致雙鏈被豐富的錯配。這些錯誤地被豐富的雙鏈稀釋在目標區域之內突變的豐富,或許使它們變得探測不到的。為了避免這個潛在的問題,我們設計了有一特別DNA序列的PCR引子,以吸引一個DNA切割酵素(MmeI)去切除在增殖作用完成後PCR產品的整個引子區域。另一可能的人為構造錯配的來源是在PCR中不精確的增殖作用;我們藉在增殖作用方面使用高保真度的PCR酵素(Pfx)減少這個潛在的問題。但是,這兩個措施不能導致PCR產品的豐富。

或許PCR反應的某些成分抑制豐富。為了調查這個,我們加了PCR 反應中的化學物或只有水到合成DNA,執行了豐富。豐富發生了在兩個環境,因此PCR反應中的化學物沒有抑制豐富。

我們的計劃是下一步設計PCR引子以一個錯配在他們的序列,執行非突變的人的DNA的PCR增殖作用,和然後測試引子錯配的豐富是否能夠發生。一個代替方法是避免在豐富前的PCR,反而使用雜交作用去從人的DNA提取目標基因,然後形成雙鏈和豐富錯配,及最後以PCR增殖。具體操作步驟如下:

1. 從組織中提取基因組DNA.
2. 用限制性内切酶消化DNA,獲得合適大小合適的DNA片斷。
3. 利用固定化的DNA探針純化目的片斷(所有的正義DNA和反義DNA)
4. 從探針上洗脫并純化目的DNA片段。
5. 溶解純化后的DNA,使正義和反義DNA雜交。
6. 利用固化的錯配結合蛋白富集錯配序列(同前面的方法)。
7. 用PCR方法擴增富集的DNA。
8. 測序,並獲得濃縮度。

我們還沒有利用此方法獲得獲得最終的實驗結果,但是在該項資助基金結束后我們依然會繼續該項試驗。